Western blot – praktisk øvelse

Under beskrives først materiale og utstyret vi skal bruke, del A. Utførelsen av øvelsen er beskrevet i del B.

Øvelsen er delt inn i fem underpunkter:

1. Først klargjør vi prøvene ved å løse opp ulikt vev, slik at cellene ødelegges og proteinene blir løst og binder SDS (sodiumdodecylsulfat). SDS tilfører negativ ladning til proteinet, slik at de kan vandre i et elektriskfelt. 
2. Deretter kjører vi SDS PAGE hvor proteinene separeres nedover i en gel etter størrelse. 
3. For å påvise proteinene med antistoff, må vi få de ut av gelen. Vi blotter proteinene fra gelen og over på en membran. En av gelene lar vi være å blotte, men farger den i stedet med et fargestoff som binder til proteinene. 
4. Når alle proteinene er på membranen, tilsetter vi primært og sekundært antistoff for å ”merke” proteinene vi er interessert i. 
5. Til sist fremkaller vi membranen og får farge der antistoffet er bundet. 

1. Tillaging av prøver for elektroforese 

Proteinene SDS og andre komponenter i prøvebufferen (lammeli sample buffer) løser opp vevet og cellene. Proteinene binder SDS og blir tilført negativ ladning.  Mekanisk ”knusing” og blanding, samt oppvarming hjelper til i denne prosessen. 

2. Protein elektroforese – SDS PAGE

Etter oppvarming er proteinene i prøven klar for å separeres. Det er ikke sikkert alt er løst, og det er fordel å bare få med oppløst materiale når vi tar ut den lille mengden (15 µl) som skal settes i brønnen på gelen. Dette gjøres med mikropipette. Det er ikke nødvendig å tilsette noe eller varme molekylvekt standarden. Den settes på som den er, men vi trenger bare 5 µl.

1. Lag 1 L elektroforese buffer per gelapparat 
2. Klargjøre ferdigstøpt gel ved å fjerne plastbånd (nederst) og ”kam” (øverst).
3. Monter gel i elektroforeseapparatet, tilsett buffer. Husk at den korte platen på gelen skal vende inn mot midten. Se for øvrig manualen for det elektroforeseapparatet dere har for hvordan man setter dette sammen. 
4. Appliser 15 µl av prøvene, 5 µl actin og myosin standard (Myo) og 5 µl Precision Plus Kaleidoscope molekylvektstandard (Mv St.) i hver sin brønn. Gjør det i denne rekkefølgen: MvSt, hjerte, torsk, myo, MvSt, hjerte, torsk, myo
5. Koble til strømmen med 200v, la elektroforesen gå i 45 min.

3. Western blotting 

Etter at SDS PAGE kjøringen har gått tre kvarter til en time ser vi på blåfargen i prøvebufferen og på molekylvektstandarden at proteinene har vandret ned i gelen. Vi slår av spenningen og tar ut gelen for å blotte proteinene over på membran, eller for å farge den. Det er viktig å være forsiktig så gelen ikke blir ødelagt, og det kan være litt vanskelig å lage en god ”blotte sandwich” som gir en god overføring av proteinene til membranen. 

1. Lag blottebuffer (1x), gjør klar et lite kar eller skål til gelen med blottebuffer.
2. Ta løs gelen fra elektroforeseapparatet. Knekk opp gelkassetten forsiktig, løsne gelen og overfør til blottebuffer. La ligge i 10 min for kalibrering. 
3. Legg to filterpapir, 2 pads og nitrocellulosemembran i et kar med blottebuffer.
4. Sett sammen blotteapparatet. Legg den svarte delen nedi et kar med bunnen dekket av blottebuffer (gjerne ved vasken, det blir ofte litt søl). Legg deretter på lagvis uten å få bobler mellom lagene: En pad, ett filterpapir, gelen, nitrocellulosemembran, ett filterpapir, en pad. Lukk kassetten og ”lås”. Sett kassetten i holder (plass til to kassetter i hver holder). Sett holder i tanken og fyll opp med blottebuffer. Husk også å putte kjøleelement/isblokk i tanken.
5. Koble på strømmen ved 100V i ca 30 min.

Farging av gel

1. Overfør gelen til kar eller skål med destillert vann (dH₂O), la ligge i 30 min, men bytt vann hvert 10 min.
2. Hell av vannet og tilsett fargeløsning, la stå 1 time. 
3. Hell av fargeløsning, vask flere ganger med dH₂O. Bytt vann hvert 10-20 min. Proteinbånd blir farget blå. Bakgrunn reduseres ved å la gelen ligge i vann over natt.

4. Blokkering og antistoffbinding til blottet

Etter blottingen av proteinene over på membran tar vi blottekassetten forsiktig fra hverandre og tar ut membranen. Hvis det har gått bra, vil vi se den fargede molekylvektstandarden på membranen. Det er viktig å merke seg hvilken side av membranen som vender mot gelen slik at vi vet hvor proteinene sitter (klipp gjerne av nedre høyre hjørne på membranene når membranen ligger slik at proteinene vender opp mot deg). Vi skal bruke antistoffene til å gjenkjenne proteinene vi er interessert i. For å forsikre oss om at antistoffet ikke bare klistrer seg til membranen (som binder proteiner godt), men faktisk binder spesifikt til antigenet på proteinet vi vil studere, tilsetter vi masse protein for å unngå uspesifikk binding. Til dette bruker vi en løsning av tørr melk (inneholder mye protein).  Vi vil bruke antistoff for å påvise Cytochrom C eller Myosin lettkjede. Siden to partier deler en gel, kutter vi den i to. Kutt midt i det ene standardsporet. Vi bruker først et primært antistoff – binder proteinet i prøven, vasker, og tilsetter et sekundært antistoff – binder det primære antistoffet. Dette er på samme måte som i ELISA.  Blokkeringsløsning, brukerløsninger av antistoff  og deteksjonsreagens skal lages rett før de skal brukes.

1) Lag blokkeringsløsning ved å blande 400 ml vaskebuffer og 20 g tørr melk. Tilsett 50ml til et kar, overfør nitrocellulosemembranen og la stå på risting i 15 min.

2) Klipp membranen i to, tvers gjennom molekylvekt standarden på midten (brønn 6).

3) Legg de to delene i hver sin petriskål med primært antistoff;

5 ml brukerløsning – anti-myosin lettkjede,

5 ml brukerløsning – anti cytochrome C 

Primært antistoff – brukerløsning:

i) Anti-myosin light chain antibody: 20 µl konsentrat + 5 ml blokkeringsbuffer – per blot

ii) Anti-cytochrome C: 5 µl konsentrat + 5 ml blokkeringsbuffer – per blot 

Løsningen med primært antistoff skal så vidt dekke membranen. Lag eventuelt mer brukerløsning om 5 ml ikke er nok.

La stå på rister ved 4°C over natt. Eventuelt kan det stå 30 min. ved romtemperatur, men vær oppmerksom på at kortere tid på risting kan gi dårligere binding av antistoff/antigen.

4) Vask hver blott med 25 ml vaskebuffer i 5 min. Gjenta to ganger.

5) Hell av vaskebuffer. Tilsett 5 ml sekundær antistoff bruker løsning – anti-mus IgG konjugert til HRP, til hver skål.

Sekundært antistoff – brukerløsning:

Secondary antibody (goat anti-mouse-HRP), 10 µl konsentrat til 5 ml blokkerinsgbuffer per blot.

Løsningen med sekundært antistoff skal så vidt dekke membranen. Lag eventuelt mer brukerløsning om 5 ml ikke er nok.

La stå på rister i 30 min. 

6) Vask som i punkt 4)

5. Deteksjon

Det er mange ulike måter å detektere proteinbånd i et western blot. Prinsippet for alle er et enzym bundet til det sekundære antistoffet. I vårt tilfelle danner enzymet et lilla produkt som dannes fra et usynlig substrat. I deteksjonsreagensen er substratet i løsning og flyter rundt, men det er usynlig. Når substratet møter enzymet på membranen, omdannes det til et lilla farget produkt som ikke lenger er løselig. Substratet feller ut og blir sittende på membranen akkurat der enzymet er. Det er lett å se med øynene da det har en klar lilla farge.

1. Hell av vaskebuffer. 
2. Lag deteksjonsbuffer: til 1 ml 10x PBS tilsettes 1 ml reagent A og 60 µl reagent B fra Horseradish peroxidase (HRP) Fyll opp med vann til 10 ml. 
3. Tilsett 5 ml deteksjonsreagens til hver petriskål. La riste forsiktig i 2-30 min, til du ser signal.
4. Når signalet er tydelig, vask som i punkt 4.4) over.
5. La membranen tørke.